Circ Res 北京大学王世强团队运用聚焦离子束扫描电镜三维重构技术揭示心肌细胞横管系统早期形态建成机制

心肌细胞的同步收缩是心脏形成强有力泵血能力的关键因素。由于心肌细胞体积大，其同步收缩是通过横管(T-tubule)将动作电位传遍心肌细胞的每个肌小节来实现的。横管网络受损或退化是心力衰竭、肥厚性心肌病、扩张性心肌病、缺血性心肌病心肌收缩力低下的共同原因。横管的形成也是心肌细胞发育成熟的关键标志；不能形成横管也是目前干细胞和心脏类器官发育成为成熟心肌组织久攻不下的关键难题。因此，阐明心肌细胞横管网络形态发生的基本规律，揭示其分子机制，不仅对认识相关心脏疾病、创新治疗思路有重要意义，也将为进一步发展干细胞和类器官技术在心脏疾病中的应用提供理论基础。

2025年6月13日，北京大学生命科学学院膜生物学全国重点实验室、国家生物医学成像中心王世强教授的研究团队在Circulation Research发表了题为“Early-stage Morphogenesis of T-tubules in Rat Cardiomyocytes: the Role of pBIN1”的研究论文。该文运用聚焦离子束扫描电镜(focused ion beam scanning electron microscopy, FIB-SEM)三维重构技术，首次揭示了心肌细胞横管网络早期形态发生的复杂性和分子机制。 

横管与肌质网的结构耦联是心肌细胞兴奋收缩耦联的基础。已有研究表明，心肌细胞肌质网的形态发生早于横管，出生后最初几天肌质网就已就位，“期待”横管的到来。对出生后不同日龄的大鼠心肌细胞用透射电子显微镜成像并进行形态计量分析表明，虽然肌质网的体积密度和表面积密度并没有明显变化，横管的体积密度和表面积密度均在大鼠出生后第12-15天之间呈现快速增长，横管-肌质网的结构耦联随之不断增加(图1)。 

图1. 新生大鼠心肌细胞横管-肌质网耦联结构的发育

为揭示横管快速增长时期的形态变化，研究团队重点选取2周龄大鼠心肌细胞对横管网络进行三维重构研究。在FIB-SEM成像系统中，聚焦离子束可以将电镜样品每10 nm做一个切面，然后通过电子束扫描对该切面进行成像。图像中，肌质网的形态可以通过其约20 nm的扁平形态来判断，与之耦联的中空膜结构可被识别为横管网络的组成部分。对连续500幅图像中的横管进行三维重构，发现心肌细胞横管系统始于细胞膜下和细胞内多发性出现的膜管生发中心(tubule hubs)，膜管生发中心发出的细管在向四面八方延伸的过程中相互连接，形成膜管网络(tubule network)。该网络以纵管而不是横管为主，膜管直径也显著小于成熟的横管，并且多数膜管起初并不与细胞膜联通(图2)。 

图2. 正常大鼠出生后2周龄心肌细胞横管的形态(左右分别列举了膜管出芽、膜管网络两种发育阶段的例图)

从生发中心发出的膜管其直径相对稳定，提示曲率塑形蛋白可能在膜管形态中发挥作用。BIN1是目前唯一已知在横管曲率塑形中发挥作用的膜蛋白。文献报道心肌细胞有Bin1、Bin+17 (二者统称uBIN1)、Bin+13、Bin+13+17四种剪切变体。王世强团队发现人和大鼠心肌细胞还存在含有磷酸肌醇结合域的Bin+11和Bin1+11+17 (统称pBIN1)两种剪切变体。在没有横管的乳鼠心肌细胞过表达pBIN1或Bin+13，可诱导膜管的发生，但uBIN1不能成管(图3)。 

图3. 不同BIN1剪切变体在新生大鼠心肌细胞的成管能力

为了探索不同的BIN1剪切变体在横管网络早期形态中的作用，该团队利用Cre-LoxP系统分别构建了第11 (11KO)和13 (13KO)外显子在心肌细胞特异性敲除的大鼠模型。对野生型和基因敲除型大鼠心肌细胞横管系统进行电子显微成像和三维重构，发现13KO虽然导致膜管网络中微折皱(microfold)结构减少，但不影响膜管生发中心和膜管网络的形成和基本形态(图4)。 

图4. 敲除BIN1第13外显子对2周龄大鼠心肌细胞膜管形态的影响(左右分别列举了膜管出芽、膜管网络两种发育阶段的例图)

与13KO不同，11KO显著减少2周龄大鼠心肌细胞的膜管数量。二维电镜图像中簇状膜泡(膜管生发中心的断面)减少(图5)。 

图5. 敲除BIN1第11外显子对膜管二维形态的影响

对11KO心肌细胞进行三维重构表明，缺少pBIN1的2周龄大鼠心肌细胞中膜管出芽、生发中心形成、膜管网络的建立都受到严重影响；膜管的直径失去均一性，呈现为粗细不等的异常形态(图6)。 

图6. 敲除BIN1第11外显子对2周龄大鼠心肌细胞膜管三维形态的影响

缺少pBIN1对膜管形态的影响也造成了心肌细胞兴奋收缩耦联功能的差异。电生理实验显示，11KO没有影响L型钙通道的电流密度，但同步进行的细胞内游离钙离子成像显示，由L型钙电流触发产生的细胞钙瞬变幅度显著降低，兴奋收缩耦联的信号增益(钙瞬变幅度除以钙电流密度)下降(图7)，呈现出与以往在心力衰竭细胞中观察到的类似功能变化。 

图7. 敲除BIN1第11外显子对2周龄大鼠心肌细胞兴奋收缩耦联功能的影响

以上发现颠覆了心肌细胞由细胞膜凹陷形成的传统观点，发现了横管系统形态发生早期出现的膜管生发中心，揭示了膜管网络初始构建的基本过程，阐明了BIN1剪切变体在膜管塑形中发挥的重要作用(图8)。这些全新的认识为未来重新认识心力衰竭、心肌病中横管形态变化，促进干细胞和心脏类器官中横管的形成，提供新的理论基础。 

图8. 心肌细胞早期横管网络形态发生机制的图形摘要

原文链接：

https://www.ahajournals.org/doi/10.1161/CIRCRESAHA.124.325472