PNAS：MYCN小分子抑制剂M606成为神经母细胞瘤靶向治疗新策略

神经母细胞瘤 (NB) 是儿童中最常见的实体肿瘤，具有高度异质性，预后差异大。其中，高危神经母细胞瘤通常对标准治疗具有抗性，且容易复发，复发后的治疗选择非常有限，其无事件生存率也较低。高危型神经母细胞瘤多伴有MYCN原癌基因的扩增，MYCN扩增与侵袭性和预后不良相关。

尽管 MYCN 在神经母细胞瘤的发病机制中的作用已经明确，但其仍属于“不可成药”靶点，而开发靶向性更好、毒性更低的新型治疗策略需求迫切。MYCN驱动的神经母细胞瘤细胞高度增殖，对铁的依赖性超过正常细胞，因此，铁螯合疗法有望成为治疗神经母细胞瘤的新型疗法。

近日，澳大利亚新南威尔士大学儿童癌症研究所的 Murray D Norris 和 Michelle Haber 等研究人员在 PNAS 上发表题为 The cell-permeable iron chelator M606 inhibits MYCN-driven neuroblastoma via an E2F3-mediated response  的文章，筛选到一种MYCN小分子抑制剂M606，其是一种高细胞通透性铁螯合剂，在MYCN扩增的肿瘤细胞中具有高度选择性，可特异性降低MYCN蛋白水平和调节葡萄糖及三羧酸代谢，并可延缓转基因小鼠肿瘤模型中肿瘤的发生进程，进一步分析发现M606通过E2F3转录因子结合位点介导MYCN下调，明确了“铁调控-E2F3-MYCN”的调控机制，发展了一种新的MYCN靶向治疗策略。

为了筛选到MYCN小分子抑制剂，研究者通过构建含MYCN响应性荧光素酶报告基因的SHR6-17细胞系，从34000种小分子化合物库，鉴定到12种潜在MYCN抑制剂 (图1A)。进一步验证分析发现N269D8喹啉类化合物有较好的抑制活性，以此为先导化合物进行优化获得M606抑制剂 (图1B)，在神经母细胞瘤细胞系BE(2)-C和HepG2中呈现剂量和时间依赖性的MYCN/c-Myc抑制效应 (图1C-D)。

并且，M606能抑制肿瘤细胞增殖和抗癌效果，Edu标记显示M606呈剂量依赖抑制细胞增殖，10 mg/kg单次给药即可抑制小鼠结肠上皮增殖 (图2A-B)；M606能抑制BE(2)-C和LAN-1克隆形成，并且对MYCN高表达神经母细胞瘤细胞系毒性大于非恶性成纤维细胞系MRC5和HSF，25 mg/kg给药显著延长TH-MYCN转基因小鼠神经母细胞瘤模型生存期 (图2C-E)。

图1 化合物库筛选确定M606为一种Myc/N抑制剂

图2 M606对MYC表达细胞系和小鼠肿瘤形成的影响

M606选择性激活HIF1A和抑制MYCN表达

Attagene转录因子阵列检测揭示M606具有高度选择性：在50种转录因子中仅显著抑制MYC通路并激活缺氧诱导因子HIF1A (图3A-B)。qPCR分析M606对HepG2细胞中HIF1A靶基因血管内皮生长因子 (VEGF-A) 和促红细胞生成素 (EPO) 表达升高，与铁螯合剂去铁胺DFO处理后结果类似 (图3C)。Western blot分析发现HIF1A蛋白在6小时内快速累积，而MYCN下调在12小时以上，在分别干扰HIF1A或MYCN表达后二者互不影响 (图3D-E)。

图3 M606抑制Myc并激活HIF1A

M606 是一种铁螯合剂，可调节葡萄糖代谢和抑制三羧酸循环

由于HIF会激活糖酵解，研究者通过测量细胞葡萄糖摄取和乳酸分泌研究M606对葡萄糖代谢的影响。结果显示M606处理后，细胞葡萄糖摄取增加2倍，乳酸分泌提升1.5倍，但谷氨酰胺代谢不受影响(图4A)。GC-MS检测显示大多数代谢在神经母细胞瘤细胞中积累了2到3倍，最显著的是柠檬酸50倍，乳酸7.5倍、琥珀酸11倍 (图4B)。乳酸增加可能是由M606介导的HIF增加引起的，但柠檬酸和琥珀酸这些TCA中间产物积累可能是因为铁硫簇Fe-S依赖的乌头酸酶(ACON)抑制引起的。

这些代谢异常均可被过量铁离子逆转，表明M606是通过铁螯合作用破坏铁硫簇依赖的乌头酸酶功能。同时，M606或M606加铁后质谱结果显示1个Fe³⁺可与3个M606分子结合 (m/z 954.4) (图4C)，表明M606是一种铁螯合剂。与临床铁螯合剂DFO和地拉罗司 (Exjade) 相比，M606还有效地降低了神经母细胞瘤细胞中MYCN蛋白水平(图4D)。

图4 M606是一种铁螯合剂，调节葡萄糖代谢和抑制三羧酸循环

M606通过E2F3转录因子介导MYCN下调

为了确定M606下调MYCN的具体分子机制，研究者分析了M606对MYCN mRNA和蛋白稳定性，显示没有差异，双荧光素酶报告系统显示M606降低了MYCN启动子活性 (全文附图S5-6)。通过构建9个分段缺失突变体，发现缺失区域8和9后MYCN启动子对M606的响应丧失，进一步将区域8分为三个100bp的片段A\B\C，50bp重叠，缩小响应M606的最小区域，结果显示8C区域介导M606的抑制效果 (图5A-E)，对8C区域序列分析发现具有三个E2F转录因子结合的保守序列和一个TGFβ抑制元件(TIE)。进一步对E2F结合序列和TIE进行分段缺失突变，结果显示E2F1/2结合区段缺失可使启动子对M606完全脱敏 (图5F)，表明E2F结合位点序列对经母细胞瘤细胞对铁螯合的反应中起着重要作用。

图5 确定MYCN启动子对M606响应的最小区域

以上结果证实MYCN启动子内两个E2F结合区段可以直接响应M606，通过ChIP实验分析E2F对MYCN启动子的结合，结果显示E2F1和E2F3均与MYCN在转录起始位点 (TSS) 处结合，但E2F3富集度更高，且M606处理使E2F3结合显著减少 (图6A)。进一步通过siRNA敲低实验发现E2F3沉默会下调MYCN表达，过表达E2F3可以挽救M606对MYCN启动子的抑制 (图6B-C)。通过EMSA实验分析MYCN启动子中的E2F保守序列对M606处理的响应，使用包含E2F结合位点的特异性探针与细胞核提取物孵育时，发现特异性E2F复合物存在，而M606处理减少了这种特定复合物 (图6D-E)，在培养基中补充Fe可以减缓M606对E2F复合物形成的抑制作用，但在孵育时补充Fe不能减缓M606对E2F复合物形成的抑制作用 (图6F)，这种逆转只在活细胞中存在。

图6 M606通过E2F3介导MYCN的下调

总之，该研究鉴定到下调MYCN和c-Myc蛋白表达的小分子抑制剂M606，在过表达MYCN的肿瘤细胞中表现出显著的抗肿瘤活性并延长小鼠肿瘤模型的生存期。M606是一种高细胞通透性的铁螯合剂，通过E2F3-MYCN轴发挥抗肿瘤作用。其中，MYCN启动子对铁离子的特殊敏感性为联合靶向治疗提供新思路，相较于传统铁螯合剂，M606优异的细胞穿透性和启动子靶向性使其成为MYCN扩增型神经母细胞瘤的潜在候选药物，其双重调控MYCN和HIF1A的特性也为克服肿瘤代谢适应性带来新启示。