Nature：患者来源类器官与反义寡核苷酸（ASO）联手：能否成为治疗罕见病的关键？

引言

近年来，个性化医疗技术的发展为罕见遗传病的治疗带来了全新的希望。其中，反义寡核苷酸(Antisense Oligonucleotides, ASOs)因其能够精准靶向特定基因，调控RNA加工或蛋白表达，逐渐成为一种颇具潜力的治疗策略。ASOs的灵活设计使其可根据患者的具体遗传变异进行定制，这种特性使其成为个性化治疗的理想工具。然而，由于个性化ASO的设计和临床前验证过程需要耗费大量时间和成本，其应用范围目前仍然受限。

1月22日Nature的研究报道“Rapid and scalable personalized ASO screening in patient-derived organoids”，提出了一种快速、可扩展的平台，通过利用患者来源的诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)和三维类器官(Organoids)模型，显著加速了个性化ASO的筛选和验证过程。这一平台不仅能够在短短几周内生成具有患者特异性的细胞模型，还能以较低的成本进行基因治疗的功能性验证。研究人员以杜氏肌营养不良症(Duchenne Muscular Dystrophy, DMD)为模型病，通过患者来源的心肌类器官验证了现有的FDA批准ASO治疗的有效性，并进一步开发了针对特定患者深层内含子突变的新型ASO。这些定制化ASO在模型中成功恢复了致病基因的功能，并显著改善了相关疾病表型。

该研究不仅验证了个性化ASO治疗的可行性，还展示了类器官模型在药物筛选中的巨大潜力。相较于传统动物模型，这种新方法能够在不到两个月的时间内完成模型建立和药物评估，极大地缩短了研究周期，为罕见遗传病的治疗探索提供了一个快速而高效的工具。

反义寡核苷酸（ASO）与个性化治疗

反义寡核苷酸（ASO）是一种短链合成核酸分子，能够通过与细胞内特定的mRNA靶标结合，从而调控RNA的加工或蛋白表达水平。ASO的核心机制包括抑制蛋白翻译、促进RNA降解以及调控RNA剪接，这种分子靶向的特点使其在治疗多种遗传病时展现出巨大的潜力。

自20世纪80年代ASO技术首次在实验室应用以来，美国已批准了超过12种ASO药物用于治疗罕见病。例如，Eteplirsen是一种针对杜氏肌营养不良症(Duchenne Muscular Dystrophy, DMD)特定基因突变的ASO药物，通过调控DMD基因的RNA剪接，恢复了部分抗肌营养不良蛋白的表达。这种基于序列靶向的灵活性为ASO在罕见遗传病中的广泛应用奠定了基础。

个性化ASO更进一步，根据患者独特的遗传变异定制治疗方案。例如，针对罕见疾病巴顿病(Batten Disease)的研究显示，特定患者定制的ASO能够显著减少其癫痫发作的频率和持续时间。这些结果表明，ASO不仅是一种通用的基因治疗工具，更是一种能够满足个体化医疗需求的重要手段。然而，传统ASO疗法的高成本和长研发周期仍是推广这一技术的重要障碍。

ASO设计的关键步骤

个性化ASO的设计需要紧密围绕患者的基因突变信息展开，整个过程包括以下几个关键步骤：

确定靶标区域：ASO的设计首先需要确认突变的具体位置及其影响范围。例如，在杜氏肌营养不良症研究中，研究人员针对DMD基因内的深层内含子突变设计了特定ASO，以阻止异常剪接位点的形成。通过患者特异性模型分析，研究团队成功恢复了基因表达，显示出ASO在修复深层剪接异常方面的潜力。

分子设计与优化：设计过程中，研究人员选择了2′-O-甲基修饰的ASO分子结构。这种化学修饰不仅能够提高ASO的靶向结合能力，还显著增强了其在细胞内的稳定性和安全性。在研究杜氏肌营养不良症的ASO时，研究人员发现，使用优化后的ASO能够有效地恢复超过40%的细胞功能，同时保持较高的细胞存活率。

功能验证与优化：验证阶段在患者来源的类器官模型中完成。研究团队通过心肌类器官测试ASO的疗效，观察到心肌细胞内钙信号的恢复，这表明ASO不仅能够恢复基因表达，还能在细胞功能层面展现明显改善。与此相比，未经优化的ASO表现出明显较低的效率。

患者来源细胞模型的突破

从外周血到iPS细胞：快速、高效的重编程技术

诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)的开发被誉为现代医学的里程碑。iPS细胞能够通过重编程成体细胞（如外周血单核细胞或皮肤成纤维细胞）获得，赋予其类似胚胎干细胞的多能性。这一过程主要依赖于转录因子组合（如OCT4、SOX2等）的引入，激活细胞内多能性基因表达，同时抑制分化标志物的表达。

近年来，重编程技术的优化使得iPS细胞的生成效率显著提升。研究人员通过添加小分子化合物和改进培养基配方，将重编程效率提高了3倍以上，同时显著缩短了培养时间。利用这种快速生成的iPS细胞，可以针对特定患者生成具有基因变异特征的细胞模型，为精准医学研究提供了坚实基础。

在该研究中，研究人员通过从杜氏肌营养不良症(DMD)患者的血液样本生成iPS细胞，成功复制了患者特异性的致病基因剪接异常。这些细胞模型不仅重现了疾病的分子机制，还为后续ASO治疗的筛选提供了可靠工具。

三维类器官的生成：再现疾病表型的微缩模型

尽管iPS细胞为遗传疾病研究奠定了基础，但其二维培养体系难以完全再现复杂的组织和器官环境。三维类器官(Organoids)技术通过在三维培养基中诱导细胞自组织形成类器官结构，为这一挑战提供了解决方案。

类器官能够在实验室中模拟真实组织的形态和功能。例如，心肌类器官不仅能够形成类似心脏的分层结构，还能展现类似心肌的跳动功能。在杜氏肌营养不良症研究中，研究人员利用患者来源的心肌类器官，观察到明显的钙信号异常和收缩功能受损，这一结果与患者临床症状高度吻合。

该研究指出，类器官模型在药物筛选中的表现尤为出色。通过将特定ASO注入DMD患者的心肌类器官，研究人员成功恢复了致病基因的正常表达，并显著改善了类器官的功能性跳动。此外，与传统动物模型相比，类器官能够在短短几周内完成生成和测试，极大地缩短了研究周期。

类器官模型在疾病机制研究和药物评估中的优势

类器官技术为疾病研究和药物筛选提供了前所未有的优势。与二维细胞培养相比，类器官在结构和功能上更接近真实组织，使其能够更准确地再现疾病的分子机制和临床特征。

精准模拟疾病表型：在杜氏肌营养不良症研究中，心肌类器官成功重现了疾病的典型特征，包括钙信号异常、收缩功能障碍等。这种基于患者特异性的疾病模型使得研究人员能够观察到ASO如何在细胞水平恢复基因功能，以及其如何改善组织层面的病理变化。

提高药物评估的可靠性：相比传统动物模型，类器官能够避免跨物种差异带来的局限性。在使用类器官评估ASO疗效时，研究人员发现其结果与患者实际的治疗反应高度一致。这种一致性显著提高了药物筛选的效率，同时减少了临床试验失败的风险。

缩短研究周期与成本：类器官的生成速度快、需求量少，且可在体外长期维持。这使得药物开发的时间和成本显著降低。例如，利用类器官筛选ASO时，研究团队能够在不到两周内完成从模型建立到疗效评估的全过程。

快速可扩展的患者来源细胞模型生成平台（Credit: Nature）

a. iPS细胞重编程工作流程的示意图

该部分展示了从患者外周血单核细胞（PBMC）到诱导多能干细胞（iPS细胞）的重编程过程，包括关键步骤和流程。

b. 患者来源iPS细胞的特征标志物表达

研究检测了患者1来源的iPS细胞中多能性标志物的表达情况，通过明场显微成像（BF）显示了细胞的形态，并通过免疫染色确认了这些细胞表达典型的iPS细胞标志物。

c. 患者来源iPS细胞的核型分析

通过核型分析显示，患者1的iPS细胞具有正常的染色体结构，证明了细胞在重编程过程中未发生显著的染色体异常。

d. iPS细胞分化为三个胚层的能力

研究进一步验证了患者1来源的iPS细胞的多能性，成功将其分化为外胚层、内胚层和中胚层细胞，显示其具有全面的分化潜能。

e. 胚状体的形成

通过患者1的iPS细胞生成胚状体（Embryoid Body），显示了这些细胞的自组织能力，为进一步的分化研究提供了基础。

f. iPS细胞分化为二维骨骼肌细胞

研究将患者1来源的iPS细胞成功分化为二维骨骼肌细胞，显示了这些细胞具有特定组织分化的能力。

g. iPS细胞分化为三维心肌和脑类器官

进一步研究显示，患者来源的iPS细胞能够分化为三维心肌类器官和脑类器官，展示了其在三维微环境中形成复杂组织结构的潜力。

h. 重编程效率与PBMC输入细胞数量的关系

通过数据分析，研究揭示了重编程效率与输入PBMC细胞数量之间的关系，提供了优化重编程流程的指导。

杜氏肌营养不良症(DMD)案例研究

杜氏肌营养不良症(Duchenne Muscular Dystrophy, DMD)是一种典型的X染色体隐性遗传疾病，主要影响男性，是最常见且严重的肌肉退行性病变之一。DMD的病因可追溯至DMD基因的突变，这一基因编码肌营养不良蛋白(Dystrophin)，一种在骨骼肌和心肌细胞膜中起到结构支撑和信号调控作用的重要蛋白。

DMD的遗传基础

DMD基因是人体中最大的基因之一，拥有超过79个外显子。由于基因长度和复杂性，DMD基因突变形式多种多样，包括外显子缺失、重复和点突变。这些突变通常会导致mRNA的不正常剪接，产生无功能或截短的肌营养不良蛋白，进而导致肌纤维的持续性损伤和退化。

数据表明，大约60%的DMD病例是由于外显子缺失引起的。这些突变不仅影响基因的表达，还可能对剪接机制造成深远影响。例如，深层内含子突变可能通过形成异常的剪接位点，进一步破坏mRNA的加工过程。由于肌营养不良蛋白在肌肉细胞中的关键作用，其缺失会导致肌肉细胞膜的不稳定性，使肌肉逐渐萎缩，最终导致患者出现严重的运动功能障碍和心肺功能衰竭。

现有治疗的局限性

尽管近年来DMD治疗取得了一定进展，但目前的治疗方法仍存在诸多限制，难以全面满足患者的需求。

对症疗法为主，难以逆转病程：传统的治疗方式包括糖皮质激素等药物，旨在延缓疾病进展，但无法解决基因突变的根本问题。此外，这些药物的长期使用可能导致骨质疏松、免疫抑制等副作用，进一步影响患者生活质量。

基因治疗的初步探索：近年来，基因编辑和ASO疗法成为DMD治疗研究的重点。ASO技术通过修饰异常剪接机制，使部分外显子跳读(Exon Skipping)，从而恢复功能性蛋白的表达。Eteplirsen作为首个获批的DMD ASO药物，能够针对DMD基因特定外显子的缺失进行跳读修正。然而，这类药物的适用范围受到严格限制，仅针对携带特定突变的患者。

该研究也指出，由于DMD突变类型多样且分布广泛，单一ASO药物难以覆盖所有患者。尤其是针对深层内含子突变的修复，现有方法的效果仍然有限。此外，基因治疗的研发成本高昂，临床转化周期长，给患者的普及使用带来显著障碍。

临床管理的复杂性

DMD不仅是一种全身性疾病，还涉及多器官系统的综合管理。除了肌肉退化外，心肌病和呼吸功能衰竭是DMD患者的主要死亡原因。针对心肌病的治疗仍是一个未被充分解决的难点，现有治疗无法全面改善心肌的病理变化。

ASO疗法的开发与验证

现有的ASO疗法，如FDA批准的Eteplirsen，主要针对DMD基因的特定外显子缺失，通过外显子跳读（Exon Skipping）修复异常剪接。这种方法旨在将患者的基因表达转变为更接近贝克型肌营养不良症（Becker Muscular Dystrophy, BMD）的基因型，从而缓解疾病症状。

该研究进一步验证了现有ASO疗法的疗效。利用患者来源的心肌类器官，研究人员发现，Eteplirsen显著恢复了肌营养不良蛋白（Dystrophin）的表达水平。在实验中，注射Eteplirsen后的心肌类器官展现出更强的钙信号调控能力以及改善的收缩功能。这些数据表明，ASO疗法不仅能够修复基因表达，还能直接改善细胞功能。然而，这种疗法仍存在适用范围有限的不足，仅适用于携带特定外显子突变的患者。

尽管Eteplirsen的成功为ASO疗法提供了重要的临床证据，但其疗效因患者突变类型和基因背景的不同而有所差异。研究表明，现有ASO疗法对深层内含子突变或复杂剪接异常的修复能力有限，这为新一代ASO疗法的开发提出了更高要求。

针对深层内含子突变的新型ASO开发

深层内含子突变（Deep Intronic Mutations）是DMD致病突变的一类特殊类型，它们通过产生异常的剪接位点或激活隐性外显子（Cryptic Exons），对基因的正常剪接造成破坏。由于这些突变难以通过传统的外显子跳读方法修复，新型ASO的开发成为攻克这一难题的关键。

该研究提出了一种创新性策略，专门针对深层内含子突变设计ASO。这些新型ASO通过精准靶向异常剪接位点，阻止错误剪接的发生，从而恢复功能性mRNA的生成。在实验中，研究人员利用DMD患者来源的心肌类器官验证了新型ASO的疗效，结果显示：

剪接修正效果显著：使用新型ASO后，致病突变引起的异常剪接被显著抑制，正常的mRNA水平恢复了约70%。这一修复效率远高于传统ASO疗法。

功能改善明确：心肌类器官的钙信号传导和收缩功能在注射新型ASO后均有明显提升，显示出疾病表型的显著改善。这些数据不仅验证了新型ASO的分子疗效，还表明其在细胞功能层面的广泛应用潜力。

多突变适用性：新型ASO展示了对多种深层内含子突变的广泛适应性，使其在更大范围的患者群体中具备潜在应用价值。

ASO与类器官技术的扩展应用

平台在其他罕见遗传病中的潜力

反义寡核苷酸（ASO）和类器官技术的结合，为杜氏肌营养不良症（DMD）患者提供了突破性的治疗方案，也为其他罕见遗传病的研究和治疗带来了新希望。这一平台的通用性使其可扩展至多种遗传病的研究，例如囊性纤维化（Cystic Fibrosis, CF）、脊髓性肌萎缩症（Spinal Muscular Atrophy, SMA）等。这些疾病通常涉及特定基因的突变，ASO可以通过靶向修正异常剪接位点或调节基因表达，恢复其功能。

研究显示，在囊性纤维化的案例中，利用患者来源的肺部类器官模型，研究人员筛选出了能够修复CFTR基因突变的新型ASO。这些ASO显著提高了细胞中氯离子通道的活性，直接改善了患者的疾病表型。此外，平台在脊髓性肌萎缩症研究中的应用表明，ASO能够增强SMN蛋白的表达，有效延缓神经退行性病变的进展。

这些成功案例展示了该平台的广泛适用性，尤其是对于目前缺乏有效治疗的罕见遗传病，ASO结合类器官技术提供了一种高效且精准的解决方案。

类器官技术的优势与改进方向

类器官技术因其独特的三维结构和功能再现能力，在疾病模型构建中具有显著优势。然而，技术的持续改进对于进一步扩展其应用范围至关重要。

与传统二维细胞培养相比，类器官技术能够更真实地模拟组织内的细胞间相互作用和微环境变化。例如，心肌类器官在研究DMD心肌病理机制时，展现了复杂的电生理特性和钙信号调控，提供了更全面的研究视角。

该研究提到，目前类器官的生成和实验结果在一定程度上受限于其个体差异和实验室条件。因此，如何实现类器官生产的标准化和高通量筛选，是未来发展的重要方向。进一步优化培养基成分和3D打印技术，有望大幅提高类器官模型的可重复性和效率。

个性化医疗是未来医学发展的重要趋势，ASO疗法与类器官技术的结合标志着这一领域的重大进步。通过基于患者特定突变开发的精准疗法，罕见遗传病患者的治疗不再是“通用方案”，而是量身定制的“个性化解决方案”。个性化ASO的开发周期从传统的数月缩短至数周。这一创新为急性遗传疾病的快速干预提供了可能性。同时，结合患者来源的类器官模型，不仅能验证药物的分子疗效，还能在功能层面展示其对疾病表型的改善。未来，随着高通量测序技术和人工智能的应用，这一平台有望进一步缩短开发周期，并在更多领域实现突破。

参考文献

Means, J.C., Martinez-Bengochea, A.L., Louiselle, D.A. et al. Rapid and scalable personalized ASO screening in patient-derived organoids. Nature (2025). https://doi.org/10.1038/s41586-024-08462-1