中科院分子细胞卓越中心惠利健、张坤Nature Protocols：原代人肝细胞的大规模扩增、三维培养与基因操作策略

肝脏是人体内承担代谢、解毒和合成功能的关键器官，肝细胞（hepatocytes）占据了肝组织约70%的质量，是肝脏功能的核心执行者。基于肝细胞的技术平台在疾病模型建立、药物筛选及细胞替代治疗等领域拥有广阔前景。然而，原代人肝细胞（PHHs）来源稀缺、无法长期体外扩增、对基因操作高度抗拒等问题，极大限制了其应用前景。

为了解决这一难题，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心惠利健、张坤等人开发了一套完整的实验流程：将PHHs诱导为增殖型人肝细胞（ProliHHs），通过优化培养基系统实现其大规模扩增，并结合三维培养与CRISPR基因编辑，探索其在疾病建模与治疗中的潜力。2025年7月25日，相关研究成果以“Expansion of human hepatocytes and their application in three-dimensional culture and genetic manipulation”为题在《Nature Protocols》期刊上发表。

【主要内容】

图1： 原代人肝细胞（PHH）培养、传代、三维培养、基因操作及移植的流程示意图

该图以简洁流程图概括了五大模块：① PHH复苏及培养；② ProliHHs扩增与传代；③ 三维培养诱导成熟；④ 基因操作（过表达、敲除、敲入）；⑤ 小鼠脾内移植验证体内功能。各步骤均有标准编号，便于实验者操作对应。

图2： 通过 HM 或 EHM 培养基建立增殖型人肝细胞（ProliHHs）

PHHs在不同培养基中诱导成为ProliHHs，健康供体使用HM，患者来源细胞（如OTCD）使用增强型培养基EHM。通过时间序列显微图和免疫荧光检测，作者证实ProliHHs保留成熟肝功能（表达ALB）同时激活前体特征（CK19、SOX9），建立了双表型、可扩增的稳定细胞体系。

图3： 在 10 cm 培养皿或培养瓶中扩增 ProliHHs 的过程

比较了传统HM和改良HM在10cm皿或培养瓶中对ProliHHs的扩增效果。多代次细胞形态图像与增殖倍数数据显示，改良HM可显著提升ProliHHs在传代过程中的扩增效率，为后续大规模应用提供了可行策略。

图4： 建立三维培养的 ProliHHs 并用于疾病建模

使用ULA非黏附培养板将ProliHHs诱导形成类肝脏微球体，模拟体内三维环境，促进其功能成熟。功能检测结果表明3D-ProliHHs相比2D培养更接近原代肝细胞，表现出更高的白蛋白分泌、尿素合成能力，并在LDL摄取实验中成功模拟了家族性高胆固醇血症（FH）患者表型，展现出在个性化疾病建模中的应用前景。

图5： ProliHHs 的基因操作

借助ProliHHs良好的扩增与转染性能，作者建立了多种基因编辑方案，包括：

慢病毒转导：用于F8等基因过表达；CRISPR–Cas9 RNP电转：实现GAPDH、AAVS1等位点敲除；AAV+HITI策略：用于实现OTC等基因高效敲入

各方法均通过流式细胞术与荧光显微镜验证其编辑效率，证实ProliHHs是适合基因治疗研究的理想模型。

图6： ProliHHs 的移植实验

将ProliHHs通过脾内注射方式移植至FRG免疫缺陷小鼠体内，模拟肝细胞替代疗法。术后5个月检测显示，移植细胞在小鼠肝脏中稳定表达人源GAPDH，证明其具有良好的体内嵌合与长期生存能力，验证了其在细胞治疗领域的应用潜力。

【全文总结】

本研究构建了一个可实现人原代肝细胞长期扩增、功能成熟与精准编辑的一体化平台，突破了PHHs在可得性、扩增性和基因操作方面的限制。通过该系统获得的ProliHHs不仅具备临床级产量，还能用于疾病建模、药物筛选及基因治疗研究，是推进肝病精准医学与细胞治疗的重要技术支撑。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41596-025-01211-2