论文解读│Jim Hu教授团队开发出一种基于荧光标记DNA寡核苷酸的Cas9 gRNA检测新方法

CRISPR/Cas9系统的发现为基因编辑领域带来了革命性的变革。这一技术通过Cas9蛋白与导向RNA（gRNA）的结合，能够精准地定位到特定的DNA序列，从而实现基因的插入、编辑和调控。Cas9蛋白可以在目标序列处制造双链断裂，以便供体DNA的整合；此外，通过突变使其核酸酶活性失活并融合脱氨酶后，Cas9可用于碱基编辑，纠正遗传突变。进一步地，Cas9蛋白还可以通过突变切割单链DNA，并与逆转录酶结合用于Prime编辑。在Prime编辑中，引导RNA（PegRNA）通过在其3'端添加RNA序列作为逆转录模板，引导融合蛋白到达目标位点。在先进的Prime编辑系统中，多种gRNA的比例对于实现精确编辑至关重要。此外，Cas9蛋白还可以与转录激活或抑制基序融合，用于调控基因表达。

gRNA在Cas9的靶向和活性中起着关键作用，其表达水平直接影响基因编辑的效率。因此，开发一种快速、便捷且低成本的gRNA检测方法显得尤为重要。传统的Northern Blotting和引物延伸方法耗时且涉及放射性同位素；而实时定量PCR虽然不涉及放射性，但需要逆转录步骤，且对于短RNA的检测效率并不稳定。

多伦多大学Jim Hu教授团队在本刊发表了题为“A novel method for detection of Cas9 gRNAs using a fluorophore-labeled DNA oligo”的研究论文，开发了一种快速、直接的gRNA检测方法。该方法通过将少量gRNA与荧光标记的DNA寡核苷酸探针在小体积溶液中杂交，随后在原生凝胶上分离杂交产物，并利用荧光检测器扫描凝胶来实现对gRNA的检测。

为验证该检测方法的灵敏度，研究团队选择了稳定性高且荧光强度强的Cy5.5标记寡核苷酸。他们将不同浓度的Cy5.5标记寡核苷酸点样于滤纸上，并利用Licor Odyssey成像仪进行扫描。结果显示，即使在亚飞摩尔水平的极低浓度下，荧光寡核苷酸也能被清晰地检测到。随后，团队通过T7 RNA聚合酶体外转录生成gRNA，并在分离杂交产物后测试gRNA检测的可行性，结果表明纳克级别的gRNA能够被荧光寡核苷酸探针成功检测到。

尽管检测灵敏度已足够，但研究团队发现，单个引导RNA的杂交产物在变性凝胶上呈现单一条带，而在原生凝胶上却出现多条带。团队推测，这可能是由于gRNA在原生条件下存在不同的构象（或二级结构）。为抑制二级结构的形成，团队在杂交过程中测试了不同浓度的尿素，结果发现4 M尿素能有效抑制二级结构，这一点从电泳后原生凝胶上呈现的单一条带中得以体现。此外，尿素的加入还增强了寡核苷酸检测的灵敏度。

为了验证该方法在总细胞RNA中检测gRNA的可行性，团队将表达不同大小Cas9引导RNA的质粒转染到哺乳动物细胞中。结果表明，相同的荧光寡核苷酸探针能够成功检测到总细胞RNA中的这些引导RNA。团队还测试了该方法用于检测哺乳动物细胞中病毒载体表达的gRNA，发现即使在少于1微克的总细胞RNA中，也能成功检测到gRNA。

图1 用于gRNA检测的快速非放射性方法及其应用 A. 通过与荧光DNA寡核苷酸进行溶液内杂交和原生凝胶电泳检测gRNA。B. 显示用于不同基因编辑应用的gRNA检测示意图。

总体而言，该研究团队成功开发了一种高效、便捷且成本低廉的gRNA检测方法（图1）。相较于传统的实时定量PCR技术，该方法不仅缩短了检测时间，还降低了成本。利用这一创新方法，团队能够在哺乳动物细胞中精准地检测到不同大小、微量的gRNA，为基因编辑研究提供了有力的技术支持。这一成果在基因治疗领域，尤其是在开发和优化Cas9介导的基因编辑策略方面，展现出巨大的应用潜力。此外，该方法还可用于深入分析gRNA的表达水平和稳定性，为提升基因编辑效率、解决相关技术难题提供了新的思路和工具，有望推动基因编辑技术在更多领域的广泛应用。

作者介绍

Ranmal Avinash Bandara：多伦多大学实验室医学与病理生物学系博士研究生，目前从事囊性纤维化基因治疗的基因编辑方法研究。

Zhichang Peter Zhou博士：多伦多大学分子遗传学系博士后研究员，专注于囊性纤维化和传染病疫苗的基因编辑传递研究。

Ziyan Rachel Chen：多伦多大学实验室医学与病理生物学系博士研究生，目前从事增强囊性纤维化基因治疗的基因编辑方法研究。

Rongqi Duan：儿童医院研究所转化医学项目技术员，擅长辅助依赖型腺病毒载体的设计和生产。

文章来源

免费全文下载链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352304225001254

引用这篇文章：

Bandara R, Zhou Z, Chen Z, et al. A novel method for detection of Cas9 gRNAs using a fluorophore-labeled DNA oligo. Genes Dis. In press.

Alan Davidson博士：多伦多大学分子遗传学系教授，专注于噬菌体技术，其团队首次发现了抗CRISPR蛋白。

Amy P. Wong博士：多伦多大学实验室医学与病理生物学系助理教授，儿童医院研究所发育与干细胞生物学项目科学家，干细胞生物学专家，开创了诱导多能干细胞分化为空气道上皮细胞的方法。Wong教授的实验室目前致力于肺部发育研究，并设计和测试针对气道疾病的疗法。

Jim Hu博士：多伦多大学实验室医学与病理生物学系教授，儿童医院研究所转化医学和病理生物学项目高级科学家。Hu教授的实验室长期致力于开发用于治疗遗传性气道疾病（如囊性纤维化）的基因治疗载体和基因编辑传递策略。